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　　熒光定量PCR技術(shù)是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過程。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，可以得到熒光擴(kuò)增曲線，計(jì)算待測(cè)樣品初始模版的量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一次由定性技術(shù)向定量技術(shù)的飛躍，運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)，可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行相對(duì)定量、定量和定性分析。

　　PCR試劑盒產(chǎn)品及特點(diǎn)：

　　1.即開即用，用戶只需要提供腸賈第蟲樣品。

　　2.根據(jù)腸賈第蟲保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。

　　3.靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。

　　4.一管式熒光定量PCR檢測(cè)，避免后續(xù)污染。

　　5.PCR試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。

　　PCR試劑盒使用方法：

　　一、稀釋PCR陽性對(duì)照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）

　　1.注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對(duì)照。

　　2.標(biāo)記6個(gè)離心管

　　3.用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

　　4.在7號(hào)管中加入5μL1×10E8拷貝/μL的陽性對(duì)照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

　　5.換槍頭，在6號(hào)管中加入5μL1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

　　6.換槍頭，在5號(hào)管中加入5μL1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

　　7.重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。

　　二、樣品DNA的制備

　　8.如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對(duì)照的第4號(hào)（濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號(hào)（濃度為1×10E5拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

　　9.用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。

　　三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

　　10.如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于PCR陽性對(duì)照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

　　11.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后加。